Cy系列荧光染料

这类染料包括Cy3，Cy3.5，Cy5，Cy5.5，Cy7和Cy7.5，其中Cy3， Cy5和Cy7的发色团是indolenine，而Cy3.5， Cy5.5和Cy7.5的是Benzoindole。Benzoindole仅仅比indolenine多了个苯环，这多余的一个苯环让整个染料吸收峰和发射峰红移，从而让Cy染料系列覆盖更广泛的荧光谱图。Cy染料的结构几乎是对称的，为了让染料可标记，这其中的一个发色团上引伸出一个6碳链羧基来活化标记。

尽管带一个正电荷，普通Cy染料的水溶性比较低。在标记生物分子时（一般在缓冲溶液中），常常需要加入有机溶液（一般5-20%的DMF或者DMSO）助溶。常规操作是将染料先溶于有机溶剂中，然后按比例加入到生物分子的水溶液中反应。反应完成后离心除去沉淀的染料，再透稀或者柱分离（HPLC，离子交换或者除盐柱）除去未反应的染料小分子。当然普通Cy染料也可以直接在有机溶剂中直接与有机小分子反应，标记小分子或者高分子材料，普通Cy染料也易溶于氯仿，甲醇，THF，乙腈等常规有机溶剂，非常适用有机合成反应。

对于近红外染料Cy7和Cy7.5，市场上一般会有两种不同的结构，不同点一般在次甲基桥链上：直链次甲基桥链或者环己烯加固的桥链。前者是一种比较原始的，直接从ICG染料继承的结构，后者是优化的结构。和前者相比，后者利用环己烯结构固定次甲基桥链，结构更刚性更稳定，因此荧光量子产率提高了~20%，从而显影更灵敏。但是需要注意的是这个仅仅只是Lumiprobe公司的说法，已有文献报道专门研究这个问题，发现环己烯固化次甲基桥链不能提高量子产率，两种Cy染料光学性能一样。另外，也有一些文献讨论两种结构的毒性差别，据报道直链次甲基桥链Cy7和Cy7.5在小动物体内有非特异性和毒性，而桥链加固后的染料要好很多。

所有的普通Cy染料有基本相同的斯托克位移（Stokes shift），大概15nm到20nm之间。这个位移足够大（其实比很多荧光染料的斯托克位移都大，比如BODIPY系列），绝大部分荧光仪器都可以将荧光信号从激发光中分辨出来。另外，溶剂和环境对普通Cy染料的荧光特性影响很小，让它们可以胜任很多条件下的显影任务，比如在低pH溶液或者脂溶性环境下都可以发出稳定的强荧光。

这类Cy染料是在普通Cy染料的发色团上加入磺酸基团从而大大增加了染料的水溶性。磺化的另一个好处是稍微提高了染料的光学稳定性和量子产率，因此磺化染料更耐受光照，发出的荧光也稍强一些。由于磺酸盐的原因，这类染料的水溶性非常高， 在标记反应中不需要加入任何有机溶剂助溶，另外标记上去的染料分子由于水溶性好不会聚集，也不会影响被标记大分子的稳定。这点非常重要，特别是当每个目标生物大分子上需要标记多个染料分子，或者目标生物大分子溶解度低，稳定性差时。 目前多荧生物可提供的磺化Cy染料包括sulfo-Cy3，sulfo-Cy3.5, sulfo-Cy5, sulfo-Cy5.5, sulfo-Cy7和sulfo-Cy7.5。

磺化后，Cy染料的荧光谱图（包括激发峰和发射峰）发生了非常细小的蓝移，这是一个非常普遍的现象，比如Rhodamine 123 到Alexa Fluor® 488，这个蓝移非常小，蓝移后激发峰和发射峰仍在仪器的检测范围之内，所以不影响使用，也不必改设仪器参数。

尽管普通Cy和磺化-Cy在荧光光学性质上面近似，但它们在适用条件和标记方法上仍有所不同。普通Cy染料水溶性低，必须预先溶解在有机溶剂（比如DMF或DMSO）中，然后加入到标记反应体系中，有机溶剂在有机/水混合溶剂中的含量需要达到10-15%（体积比率）才能保证染料不析出。相反，磺化-Cy染料在水中溶解性很好，可直接在水溶液（比如PBS缓冲液）中标记，因此特别适用于蛋白等对有机溶剂敏感的标记对象。如果希望反应后通过透析的方式纯化，务必使用磺化-Cy染料，磺化-Cy染料溶于水，多余的染料可以被透析出。如果通过离子交换树脂、电泳、凝胶过滤法纯化，普通Cy和磺化-Cy都适用。

普通Cy和磺化-Cy的适用条件分以下几种情况：

两种染料都适用:

· 较稳定的蛋白类，可承受少量有机溶剂长达数小时的

· 抗体（一般可承受5-10% of DMSO/DMF）

· DNA、RNA等核酸类

· 天然或者有机合成的高分子材料

· 多肽

· 可溶于DMF、DMSO、甲醇的小分子化合物

必须使用磺化-Cy染料:

· 敏感性蛋白，特别是有机溶剂会诱导变性的蛋白

· 需透析纯化的

· 对有机溶剂敏感的纳米材料

必须使用普通Cy染料:

· 必须在氯仿、乙醚等水不混溶型有机溶剂中标记的反应

· 标记后的产物希望仍然脂溶型或者希望其仍可透过细胞膜的探针

· 需要包裹装载的，比如载入纳米核的疏水微环境